一些吖啶酯或者吖啶磺酰胺中都含有NHS基团，该基团不参与化学发光反应，但是它是吖啶酯能直接标记和交联蛋白质、抗体或酶的关键基团，是可以与胺反应的交联剂，在吖啶酯、荧光素以及其它生物分子探针中都应用普遍。
吖啶酯NHS酯标记蛋白
吖啶酯中NHS酯的结构
NHS酯指的是N-羟基琥珀酰亚胺（或N-羟基丁二酰亚胺）中的羟基脱去氢，与吖啶酯中羧基脱去羟基后的羰基相连而形成的特殊酯（-COO-N-）。这种酯可以与蛋白上的伯胺（一级氨基）反应，NHS酯中羰基相连的C-O键断裂脱去NHS基团，然后羰基与蛋白氨基相连形成-CONH-酰胺键（即蛋白中羧氨脱水缩合形成的肽键），从而与蛋白质连接达到标记蛋白的目的。后续通过化学发光反应，以检测被吖啶酯标记的蛋白。
NHS酯的优势
与伯胺（-NH2）反应的化学基团有很多，也有一些吖啶酯以其它的方式来标记蛋白或者多肽，但是NHS酯更加通用和普遍。伯胺存在与每个多肽链或蛋白的N-端和赖氨酸（Lys，K）氨基酸残基的侧链中，即大多数蛋白都可被NHS酯标记。这些伯胺在生理 pH 下带正电； 因此，它们主要发生在天然蛋白质三级结构的外表面上，很容易与引入水性介质中的结合试剂发生反应。此外，在典型的生物学或蛋白质样品的化学官能基团中，伯胺尤为具有亲核性，易与几个反应性基团靶向结合，如NHS酯、异硫氰酸酯以及有些吖啶酯中用的碳二亚胺等。
吖啶酯NHS酯使用注意
NHS酯水解与伯胺反应产生竞争，水解速率随pH增加而增加，所以低浓度蛋白记率会下降，所以吖啶酯标记蛋白时优先在生理至弱碱性环境pH（7.2-9）下完成。缓冲液可用磷酸盐、碳酸盐、HEPES或硼酸盐缓冲液，含伯胺的Tris缓冲液会竞争而不相容，标记步骤结束可用Tris或甘氨酸缓冲液猝灭。德晟是化学发光试剂厂家，可提供含NHS及其它交联结构的吖啶酯及相关缓冲剂。
